1、计数器测定法。
即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。
2、电子计数器计数法。
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化,小孔仅能通过一个细胞,当一个细胞通过这个小孔时,电阻明显增加,形成一个脉冲,自动记录在电子记录装置上。
3、活细胞计数法。
常用的有平板菌落计数法,是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
4、比浊法。
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
5、测定细胞重量法。
此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;
6、测定细胞总氮量或总碳量。
氮、碳是细胞的主要成分,含量较稳定,测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。
7、颜色改变单位法。
这种方法通常用于很小,用一般的比浊法无法计数的微生物。
现在用的多的就是这几种,楼主挑着看吧
细菌计数1.计数器测定法:
即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3),因而根据计数器刻度内的细菌数,可计算样品中的含菌数。本法简便易行,可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数,也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化,小孔仅能通过一个细胞,当一个细胞通过这个小孔时,电阻明显增加,形成一个脉冲,自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确,但它只识别颗粒大小,而不能区分是否为细菌。因此,要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法
常用的有平板菌落计数法,是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液,作一系列的倍比稀释,然后将定量的稀释液进行平板培养,根据培养出的菌落数,可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高,是一种检测污染活菌数的方法,也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意:①一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数,过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延,影响计数,可在培养基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验,是最常用的活菌计数法。
4、比浊法
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比,与光密度成正比,所以,可用光电比色计测定菌液,用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷,但只能检测含有大量细菌的悬浮液,得出相对的细菌数目,对颜色太深的样品,不能用此法测定。
5、测定细胞重量法
此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后,以清水洗净放人干燥器加热烘干,使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品,是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
6、测定细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分,含量较稳定,测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。
7、颜色改变单位法(colour change unit,简称CCU)
这种方法通常用于很小,用一般的比浊法无法计数的微生物,比如支原体等,因为支原体的液体培养物是完全透明的,呈现为清亮透明红色,因此无法用比浊法来计数,由于支原体固体培养很困难,用cfu法也不容易计数,因此需要用特殊的计数方法,即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标,来计数微生物的相对含量的,下面以解脲脲原体为例单介绍其操作:,简
(1)取12只无菌试管,每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。
(2)在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液,充分混匀,从中吸取0.2ml加入第二管,依次类推,10倍梯度稀释,一直到最末一管
(3)于37度培养,以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU,也就是支原体的最大代谢活力,比如第六管出现颜色改变,他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.
一般来说,比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数,但是对支原体这样比较特殊的微生物,用CCU法比较合适。
普通光学显微镜、血球计数板、吸水纸、盖玻片、吸管、移液枪、枪头、离心管、镊子(取用盖玻片)、无水乙醇或 95% 乙醇溶液、
如果需要将细胞进行稀释需要加入培养基吗?还是生理盐水,缓冲溶液都可?
二、实验步骤
血球计数板的准备:取血球计数板,检测血球计数板是否清洁,如果有污垢,应先洗涤干净并擦干。用无水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭计数板后,用绸布擦净,另擦净盖玻片一张。先在低倍镜下,熟悉计数板和计数区的构造。
加盖玻片,盖住血球计数板两边的小槽。
制备细胞悬液:将动物细胞用稀释液制备成适当浓度的细胞悬液备用。
(如果需要染色,需要在充液之前将染色液按照一定的比例加入细胞悬液中)
充液: 用滴管或者移液器将一小滴震荡混匀的稀释的细胞悬液滴在盖玻片边缘的玻片上,细胞悬液借毛细管现象自动渗入计数室中。如果加入的液体过多,会进入计数取两侧的凹槽内,使盖玻片浮起,需要用滤纸把多余的液体吸出。
避免滴入过少细胞悬液,易产生气泡。如果加入的过少,需要洗净计数板,干燥后重做。
充液后静置1-2min,待细胞下沉后,方可计数。
先用低倍镜找到血球计数器的计数区。
计数结束后,清洗计数板,整理试验台。
三、计数原理
1、熟悉血细胞计数板的计数区
2、计数时只计数中央
3、细胞浓度计算
细胞浓度计算公式:
细胞浓度(细胞个数/mL) = (80小方格内细胞个数÷80)×400×104×稀释倍数
4、细胞计数原则
计数区每个中方格内16个小方格要依次计数,遵循 S形计数原则。
在计数靠近中方格边线(为双线)的细胞时,遵循“计上不计下,计左不计右”原则。
如发现各中方格中的细胞数目相差20个以上,表明细胞分布不均匀,须重新计数。
四、实验注意事项
血球计数板为易碎品,请务必轻拿轻放。
检查计数板,确保清洁。
方格网的分隔线无色,在相差显微镜下更容易看到。
充液时,避免滴入过多细胞悬液,溢出并流入两侧槽内,使盖玻片浮起。避免滴入过少细胞悬液,易产生气泡。
计数时,只计数完整的细胞,若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。
二次重复计数误差不应超过 ±5%
如果细胞数量较多的情况下,可取一滴(或100ul)细胞混悬液+八滴(或800ul)细胞培养液+一滴(或100ul)苔盼蓝,这样最终稀释倍数为十倍。
五、染色计数
如果需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活,确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度,如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别,冻存细胞复苏后的活力检测等。
细胞悬液制备后,常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色,进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细胞内而使细胞着色(蓝色)。
1、用滴管吸取 0.4% 台盼蓝染液,按 1∶1 比例加入细胞悬液中。
2、镜下观察,凡折光性强而不着色者为活细胞,染上蓝色者为死细胞。
3、计数细胞后,计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。
参考网址:
;id=1213913014cid=1217906593(中国大学慕课-细胞与显微技术实验课程)
(丁香园-献给初学者:手把手教你做细胞计数实验)
文章文字稿整理自中国大学慕课
血球计数板和细胞(细菌??)计数器都是用于测量细胞总数的。
血球计数板适用于酵母、真菌孢子,细菌计数器适用于细菌。
是将它们放在普通光学显微镜下或相差显微镜下直接观察并记录一定体积中的平均细胞数。
用于测量细胞总数,但是不能区分死菌和活菌,但是可以用染色的方法区分开从而改良方法。
牛奶中也是有可能有细胞的啊,比如牛的乳腺如果发生病变......不过这个不算问题吧......
细胞计数器用处可就比较多了,像医院进行的一些常规检测,比如人体有炎症时血液内白细胞数目就会增多,还有细胞相关的科研方面都要用到的。
早期是半自动的,就是查一个细胞按一下,最后看得数。现在高级了,有全自动细胞计数仪,进口的要几十W。
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